Liyofilizasyon amaçlı kullanılan sulandırıcıların koç spermasının DNA bütünlüğü üzerine etkisi

Abstract

DNA hasarının belirlenebilmesi, sperma saklama yöntemlerinin geliştirilmesi açısından önemlidir. Biz çalışmamızda farklı liyofilizasyon medyumları kullanılarak saklanan sperm hücrelerinin DNA bütünlüğünün değerlendirilmesinde akridin oranj (AO) ve therminal deoxynucleotidyl transferase-medited dUDP nick and labelling (TUNEL) floresan boyama yöntemlerini kullandık. Koçlardan alınan sperma dört gruba bölündü ve her bir grup: I) %10 fötal buzağı serumu (FCS) içeren TCM 199 solüsyonu II) %10 FCS ve 0,2 mol/L trehaloz içeren TCM 199 solüsyonu III) 50 mmol/L NaCl ve EGTA [Ethylen glycol-bis (β-aminoethyl ether)-N, N, N, N,-tetraacetic acid] 10 mmol/L Tris solüsyonu ve IV) %20 yumurta sarısı ve %7 gliserol içeren Tris bazlı solüsyonlardan biri ile konsantrasyonu 10 x 106 spermatozoa/100 μL olacak şekilde sulandırıldı. Taze alınan spermada DNA fragmentasyon oranı AO ve TUNEL yöntemlerinde sırasıyla %2,0 ±1,2 ve %3,8±3,7 olarak tespit edildi (P>0.05). AO ve TUNEL yöntemiyle değerlendirilen liyofilizasyon sonrası DNA bütünlüğüne sahip spermatozoa oranlarının, sulandırıcı farklılığına göre etkilenmediği tespit edildi (P>0.05). Aynı şekilde her iki boyama yöntemi karşılaştırıldığında, liyofilizasyon sonrası elde edilen DNA bütünlüğünün değerlendirilmesinde AO ve TUNEL sonuçlarının istatistiksel olarak farklı olmadığı belirlendi (P>0.05). Çalışmamızın sonuçları; sulandırıcı gruplarından her birinin koç spermasının liyofilizasyonu için uygun olduğunu ve her iki boyama yönteminin de tercih edilebileceğini göstermektedir.

The ability to detect nuclear damage is an important tool for the development of sperm preservation methods. We used the acridine orange (AO) and the therminal deoxynucleotidyl transferase-medited dUDP nick and labelling (TUNEL) assay to evaluation of DNA status of sperm cells preserved with different lyophilization media. Collected ram semen were divided into four groups and diluted to a 10x106 spermatozoa/100μL with one of the extender: I) TCM 199 contained 10% fetal calf serum (FCS), II) TCM 199 contained 10% FCS and 0,2 mol/L trehaloz, III) 10 mmol/L Tris contained 50 mmol/L NaCl and EGTA [Ethylen glycol-bis (β-aminoethyl ether)-N, N, N, N,-tetraacetic acid] and IV) Tris based semen extender contained 20% egg yolk and 7% glycerol and then diluted semen were lyophilized. Freshly collected semen DNA fragmentation rate was 2,0% ±1,2 and 3,8%±3,7 obtained by AO and TUNEL assay, respectively (P>0.05). The DNA integrity of rehydrated spermatozoa as determined by AO and TUNEL assays were not affected by freeze-drying extender (P>0.05). Similar results were obtained by AO and TUNEL assays after rehydration (P>0.05). The results of this study showed that each of the diluent groups is suitable for lyophilization of ram semen and that both staining methods can be preferred.