Genome-based identification of aquatic Aeromonas spp., isolates and evaluation of their virulence potentıal using in vitro assays and the Galleria mellonella infectıon model

Abstract

Aeromonas türleri sucul ortamlarda yaygın olarak bulunan, balıklar ve insanlar için fırsatçı patojenler olarak tanımlanan Gram-negatif, fakültatif anaerob bakterilerdir. Su ürünleri yetiştiriciliğinde hastalık salgınlarına neden olmaları ve zoonotik potansiyelleri, bu türlerin virülens özelliklerinin detaylı şekilde anlaşılmasını gerekli kılmaktadır. Bu çalışmada, 17 Aeromonas izolatının patojenik potansiyeli; fenotipik testler, Galleria mellonella larvalarıyla yapılan in vivo enfeksiyon modeli ve tüm genom dizileme yöntemiyle değerlendirilmiştir. Fenotipik analizlerde izolatlar arasında belirgin farklılıklar gözlemlenmiştir. 12 izolatta hemolitik aktivite saptanırken, 11 izolatta DNaz ve 10 izolatda lipaz aktivitesi tespit edilmiştir. İzolatların büyük çoğunluğu hareketli bulunmuş, yedi izolat ise indol üretmiştir. Galleria mellonella larvalarında yapılan enfeksiyon deneylerinde suşlara özgü ve doza bağımlı virülens gözlemlenmiştir. 4 izolat (A-6, A-12, A-13 ve A-15), 10⁷ CFU/larva dozunda 24 saat içinde tam mortaliteye neden olurken, A-1, A-2 ve A4 gibi diğer suşlar daha zayıf veya gecikmeli virülens göstermiştir. Virülens farklılıklarının genetik temellerini araştırmak amacıyla izolatların genomları, Illumina ve Nanopore platformları kullanılarak dizilenmiş ve Unicycler ile hibrit montaj yapılmıştır. Tür düzeyinde tanımlamalar Ortalama nükleotid kimliği (ANI) ve dijital DNA–DNA hibridizasyon (dDDH) yöntemleriyle doğrulanmıştır. Genom anotasyonu sonucunda en fazla yapışma (adherence) ile ilişkili genler (n=1.923), ardından salgı sistemleri (n=685) ve toksin (n=59) genleri tespit edilmiştir. Antifagositik mekanizmalar ve demir alımına ilişkin genler daha az sayıda bulunmuştur. Antibiyotik direnç analizleri, penisilin (n=14), karbapenem (n=13) ve sefalosporin (n=12) gibi β-laktamlara karşı direnç genlerinin yaygın olduğunu, ayrıca tetrasiklin ve florokinolonlara (n=11’er) karşı direnç genlerinin de sıkça bulunduğunu göstermiştir. Bu bulgular, Aeromonas türlerinde virülensin yalnızca genetik potansiyelle değil, aynı zamanda fenotipik düzeydeki ifadeyle şekillendiğini ve bu durumun suşlar arasında önemli ölçüde değişkenlik gösterdiğini ortaya koymuştur. In vitro testler, larval enfeksiyon modeli ve genomik analizlerin birlikte kullanılması, izolatların patojenik profillerinin ayrıntılı şekilde karakterize edilmesini sağlamıştır. Bu çalışma, sucul Aeromonas suşlarının virülens mekanizmalarına dair anlayışı derinleştirmenin yanı sıra, yüksek riskli suşların tespiti ve zoonotik tehditlerin izlenmesi için pratik bir yaklaşım sunmaktadır.

Aeromonas species are widespread in aquatic environments and are increasingly recognized as opportunistic pathogens affecting both fish and humans. Their involvement in disease outbreaks in aquaculture, along with their zoonotic potential, underscores the importance of understanding their virulence characteristics. This study investigated the pathogenic potential of 17 Aeromonas isolates through a combination of laboratory-based phenotypic assays, larval infection experiments, and wholegenome sequencing. Phenotypic screening showed notable variation among isolates. Thirteen strains exhibited hemolytic activity, while DNase and lipase activity were observed in 11 and 10 strains, respectively. Motility was detected in most isolates, and indole production was identified in seven. Virulence was further assessed in Galleria mellonella larvae, revealing strain-specific and dose-dependent effects. Four isolates (A-6, A-12, A-13, and A-15) caused complete mortality within 24 hours at 10⁷ CFU/larva, whereas others such as A-1, A-2, and A-4 were less virulent. To investigate the genetic basis of these differences, genomes of the isolates were sequenced using both Illumina and Nanopore platforms and assembled via a hybrid approach. Species identification was confirmed through average nucleotide identity (ANI) and digital DNA–DNA hybridization analysis. Genome annotation revealed a high number of adherence-related genes (1,923), followed by genes involved in secretion systems (685) and toxins (59). Genes associated with antiphagocytic mechanisms and iron uptake were less frequently observed. Resistance gene profiling showed widespread presence of β-lactam resistance determinants, including genes targeting penicillins, carbapenems, and cephalosporins. Tetracycline and fluoroquinolone resistance genes were also common. These results demonstrate that virulence in Aeromonas is shaped by a complex interplay between phenotypic expression and genomic potential, which varies substantially between strains. The combined use of in vitro assays, larval infection models, and whole-genome analysis allowed for a nuanced characterization of each isolate’s pathogenic profile. This work not only deepens our understanding of virulence mechanisms in aquatic Aeromonas spp. but also provides practical tools for identifying high-risk strains in aquaculture and monitoring their zoonotic threat.