Epilobium hirsutum L. ekstresinin prostat kanseri hücre hatlarındaki sitotoksik etkisinin moleküler düzeyde incelenmesi

Abstract

Bu çalışmada; halk tıbbında birçok prostat hastalığının tedavisinde kullanılan ve ülkemizde doğal olarak yetişen Epilobium hirsutum L. (tüylü yakı otu) bitkisinin, DU 145 ve PC-3 insan androjen bağımsız prostat kanseri hücre hatları üzerindeki sitotoksik etkisinin moleküler düzeyde araştırılması amaçlanmıştır. Bu kapsamda, ham ekstrelerin ve kaba fraksiyonların hazırlanmasında ʽbiyolojik aktivite rehberli fraksiyonlamaʼ yaklaşımı temel alınmıştır. Bitkinin toprak üstü kısımlarından, maserasyon yöntemiyle A (n-hekzan), B (diklorometan), C (%100 metanol), D (%80 metanol) ve E (su); Soxhlet ekstraksiyonuyla F (n-hekzan); Soxhlet ekstraksiyonu sonrası maserasyon ve geri soğutucu yöntemleriyle G (%80 metanol) ve H (%80 metanol); infüzyon yöntemiyle K (su) kodlu ekstreler elde edilmiştir. Aktif ekstreden ise kaba fraksiyonlama yapılmıştır. Ekstrelerin ve fraksiyonların sitotoksik aktiviteleri, SRB ve XTT hücre canlılık testleriyle taranmıştır. Sitotoksik ekstre/fraksiyon dozlarının neden olduğu ölüm şekli, M30 ELISA ve ikili boyama (Hoechst 33342/propidyum iyodür) yöntemleriyle analiz edilmiştir. Hücre ölüm yolaklarında görevli gen ve protein ekspresyonları ise, kantitatif gerçek zamanlı PZR ve western blot analizleri ile belirlenmiştir. Elde edilen bulgulara göre; en güçlü sitotoksik etkiyi E kodlu ekstrenin gösterdiği ve bu ekstreden hazırlanan E1 (kloroform), E2 (etil asetat), E3 (n-butanol) ve E4 (su) kodlu fraksiyonların ekstre kadar etkili olmadıkları tespit edilmiştir. Bu sonuç, ekstredeki etken maddelerin birlikte bulunmaları durumunda sinerjik etki göstermeleriyle açıklanmıştır. Sitotoksik (>IC50) ve sitotoksik olmayan (<IC50) ekstre (E) ve paklitaksel ile oluşturulan kombinasyonlarda sitotoksik aktivitelerin baskılandığı görülmüştür. Ekstrenin (E), otofaji ile apoptozu birlikte aktive ederek hücre ölümüne neden olduğu belirlenmiştir. Bu veriler ışığında, aktif E. hirsutum ekstresinin fitokimyasal içeriklerinin analiz edilmesi ve in vivo etkilerinin değerlendirilmesi gerektiği sonucuna ulaşılmıştır.In this study; it is aimed to investigate cytotoxic effect of Epilobium hirsutum L. (hairy willow-herb) plant, which is used in treatment of many prostate diseases in folk medicine and grows naturally in our country, on DU145 and PC-3 human androgenindependent prostate cancer cell lines at molecular level.In this context, ʽbiological activity guided fractionationʼ approach was taken as basis in preparation of raw extracts and fractions. From the above-ground parts of plant, A(n-hexane), B(dichloromethane), C(100% methanol), D(80% methanol) and E(water) by maceration; F(n-hexane) by Soxhlet extraction; G(80% methanol) and H(80% methanol) by maceration and backcooler after Soxhlet extraction; K(water) extracts were obtained by infusion. Fractionation was made from active extract. Cytotoxicity of extracts and fractions were screened by SRB and XTT cell viability tests. The mode of death caused by cytotoxic extract/fraction doses was analyzed by M30 ELISA and double-staining(Hoechst 33342/propidium iodide). Gene and protein expressions involved in cell death pathways were determined by quantitative real-time PCR and western blot analysis. According to findings; E1(chloroform), E2(ethylacetate), E3(n-butanol) and E4(water) fractions prepared from this extract were found to have strongest cytotoxic effect. This result was explained by their synergistic effect when active ingredients in extract were present together.In combination with cytotoxic(>IC50) and non-cytotoxic(<IC50) extract(E) and paclitaxel, cytotoxic activities were suppressed. It has been determined that extract(E) causes cell death by co-activating autophagy and apoptosis. In light of these data, it was concluded that phytochemical content of active E. hirsutum extract should be analyzed and its in vivo effects should be evaluated.