Glukoamilaz enziminin metal-şelat afinite yöntemi ile poli(etilen glikol dimetakrilat 1-vinil-1,2,4-triazol) mikroküreler üzerine immobilizasyonu

Abstract

Poli(etilen glikol dimetilakrilat-1-vinil-1,2,4-triazol) [poli(EGDMA-VTAZ)] hidrojel (ortalama çap 150-200 μm) etilen glikol dimetilakrilat (EGDMA) ve 1-vinil-1,2,4-triazol (VTAZ)’ın kopolimerizasyonu ile hazırlandı. Cu2+ iyonları poli(EGDMA-VTAZ) mikroküreleri üzerine şelatlaştırıldı ve daha sonra metal-şelatlanmış mikroküreler kesikli sistemde glukoamilaz enzimi adsorbsiyonunda kullanıldı. Poli(EGDMA-VTAZ)-Cu2+ mikrokürelerinin maksimum glukoamilaz adsorbsiyon kapasitesi pH 6.5’te 104 mg/g olarak belirlendi. Serbest haldeki glukoamilaz enzimi pH 4.5 ‘da maksimum aktivite gösterirken bu değer immobilize enzim için pH 4 olarak belirlenmiştir. Serbest enzim için 60 oC olan optimum sıcaklık ise immobilize enzim için 65 oC ‘ye kaymıştır. İmmobilizasyon glukoamilaz enzimin sıcaklığa karşı olan dayanıklılığını da arttırmıştır. 60–70 oC ‘de 180 dakika inkübasyon sonucunda immobilize enzimin serbest enzime göre çok daha yüksek aktivite değerleri gösterdiği belirlenmiştir. Depolanma kararlılığı, immobilize enzimlerin serbest enzimlere göre üstünlük gösterdiği özelliklerden biridir. Serbest glukoamilaz enzimi 20 gün içerisinde aktivitesinin tamamını kaybederken immobilize enzim aynı süre içerisinde aktivitesinin sadece % 5 ‘ini kaybetmiştir. Glukoamilaz enziminin Michaelis sabiti, Km adsorbsiyona bağlı olarak artarken Vmax değeri azalmıştır, bu da enzimin substratına karşı olan afinitesinin azaldığının bir göstergesidir. İmmobilize enzimlerin en önemli avantajlarından biri de tekrar kullanımdır. 10 kez tekrar kullanım sonucunda immobilize glukoamilaz enziminin aktivitesinin %76 ’sını koruduğu belirlenmiştir ki, bu da biyokatalitik uygulamalarda enzim bağlanmış mikrokürelerin ne kadar kullanışlı olduğunu göstermektedir.Poly(ethylene glycol dimethacrylate-1-vinyl-1,2,4-triazole) [poly(EGDMA–VTAZ)] hydrogel (average diameter 150–200 μm) was prepared by copolymerizing ethylene glycol dimethacrylate (EGDMA) with 1-vinyl-1,2,4-triazole (VTAZ). Cu2+ ions were chelated on the poly(EGDMA–VTAZ) beads , then the metal-chelated beads were used in the adsorption of glucoamylase in a batch system. The maximum glucoamylase adsorption capacity of the poly(EGDMA–VTAZ)–Cu2+ beads was observed as 104 mg/g at pH 6.5. The maximum relative activity of the free glucoamylase was observed at pH 4.5, whereas the optimal pH value to get which of that was at 4.0 for the immobilized glucoamylase. The optimal temperature of free glucoamylase was at 60 oC and the immobilized enzyme was shifted to 65 oC. The immobilization remarkably enhanced heat and denaturation resistance of glucoamylase. After incubation at 60–70 oC for 180 min, the immobilized glucoamylase remained higher activity in comparison with the free one. Storage stability is one of the important advantages for immobilized enzymes over the free enzymes because free enzymes can lose their activities fairly quickly. The free glucoamylase lost its whole activity within 20 days. However, the immobilized glucoamylase on the poly-(EGDMA-VTAZ)–Cu2+ beads lost only 5% of its activity during the same period. The value of the Michaelis constant Km of glucoamylase was larger upon adsorption, indicating decreased affinity by the enzyme for its substrate, whereas Vmax was smaller for the adsorbed glucoamylase. The most important advantage of immobilization is repeated use of enzymes. The glucoamylase adsorption capacity was not changed during the 10 successive adsorption–desorption cycles. Adsorbed glucoamylase retains an activity of 76 % after 10 batch successive reactions, demonstrating the usefulness of the enzyme-loaded beads in biocatalytic applications.